紫外-可見(UV-Vis)光譜是一種廣泛應(yīng)用于許多科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)，從細(xì)菌培養(yǎng)、藥物鑒定和核酸純度檢查和定量，到飲料行業(yè)的質(zhì)量控制和化學(xué)研究。本文將介紹UV-Vis光譜的工作原理、如何分析輸出數(shù)據(jù)、該技術(shù)的優(yōu)勢和局限性以及它的一些應(yīng)用。
什么是紫外可見分光光度計？
UV-Vis光譜是一種分析技術(shù)，它測量與參考或空白樣品相比樣品吸收或透射過的UV或可見光的離散波長的數(shù)量。此屬性受樣品成分的影響，分析結(jié)果可能會提供有關(guān)樣品中成分和濃度的信息。由于這種光譜技術(shù)依賴于光的使用，所以讓我們首先談一談光的特性。
光具有與其波長成反比的一定量的能量。因此，較短波長的光攜帶更多的能量，而較長波長的光攜帶較少的能量。需要特定量的能量來將物質(zhì)中的電子提升到更高的能量狀態(tài)，我們可以將其檢測為吸收。物質(zhì)中不同鍵合環(huán)境中的電子需要不同的特定能量來將電子提升到更高的能量狀態(tài)。這就是為什么在不同物質(zhì)中對不同波長會發(fā)生光吸收的原因。人類能夠看到一系列可見光，從大約380nm（我們看到的紫色）到780nm（我們看到的紅色）。紫外光的波長比可見光短，約為100nm。因此，光可以通過其波長來描述，這在UV-Vis光譜中可用于通過定位與大吸光度相對應(yīng)的特定波長來分析或識別不同的物質(zhì)（參見下文中UV-Vis光譜的應(yīng)用部分）。
紫外可見分光光度計如何工作？
雖然UV-Vis分光光度計有許多類型，但為了更好地了解UV-Vis分光光度計的工作原理，我們主要考慮分光光度計的主要組件，如下圖1所示。
圖1：紫外可見分光光度計主要組件的示意圖。
1、光源
作為一種基于光的技術(shù)，一個能夠在很寬的波長范圍內(nèi)發(fā)射光的穩(wěn)定光源是必不可少的。單個氙氣燈通常用作紫外線和可見光范圍的高強(qiáng)度光源。然而，與鎢燈和鹵素?zé)粝啾?，氙氣燈的成本更高且穩(wěn)定性較差。
對于使用兩個燈的儀器，鎢燈或鹵素?zé)敉ǔＳ糜诳梢姽?，而氘燈是紫外光的常見光源。由于需要兩種不同的光源來掃描紫外和可見波長，因此在測量過程中須切換儀器中的光源。在實(shí)踐中，這種切換通常發(fā)生在300和350nm之間的掃描范圍，其中來自兩個光源的光發(fā)射相似，并且可以更平滑地進(jìn)行轉(zhuǎn)換。
2、波長選擇
在下一步中，須從光源發(fā)出的寬波長中選擇適合用于檢測的樣品類型和分析物的特定波長的光進(jìn)行樣品檢查。常用的方法包括：
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單色器
單色器將光分成窄的波長帶。它通?；诳梢孕D(zhuǎn)的衍射光柵來選擇入射角和反射角，從而選擇所需的光波長。衍射光柵的凹槽頻率通常以每毫米的凹槽數(shù)來衡量。更高的凹槽頻率提供更好的光學(xué)分辨率，但可用波長范圍更窄。較低的凹槽頻率提供較大的可用波長范圍，但光學(xué)分辨率較差。每毫米300到2000個凹槽可用于紫外可見光譜目的，但通常每毫米至少有1200個凹槽。光譜測量的質(zhì)量對衍射光柵和光學(xué)裝置中的物理缺陷很敏感。因此，刻劃衍射光柵往往比閃耀全息衍射光柵具有更多的缺陷。閃耀全息衍射光柵往往能提供明顯更好的測量質(zhì)量。
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吸收濾光片
吸收濾光片通常由有色玻璃或塑料制成，旨在吸收特定波長的光。
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干涉濾光片
也稱為二向色濾光片，這些常用的濾光片由多層介電材料制成，其中在薄層材料之間發(fā)生干涉。這些濾光片可用于通過相消干涉除不需要的波長，從而充當(dāng)波長選擇器。
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截止濾光片
截止濾光片允許低于（短波）或高于（長波）特定波長的光通過。這些通常使用干涉濾波器來實(shí)現(xiàn)。 -
帶通濾波器
帶通濾波器允許一系列波長通過，這可以通過將短波和長波濾波器組合在一起來實(shí)現(xiàn)。
由于其多功能性，單色儀常用于該過程。然而，濾光片通常與單色器一起使用，以縮小選擇的光波長以進(jìn)行更好的測量并提高信噪比。
3、樣品分析
無論在分光光度計中使用哪種波長選擇器，光都會穿過樣品。對于所有分析，測量參考樣品（通常稱為“空白樣品”）（例如裝有用于制備樣品的類似溶劑的比色皿）是必不可少的。如果使用含有樣品的緩沖溶液進(jìn)行測量，則使用不含目標(biāo)物質(zhì)的緩沖溶液作為參考。檢查細(xì)菌培養(yǎng)物時，將使用無菌培養(yǎng)基作為參考。參考樣品信號隨后由儀器自動使用，以幫助獲得分析物的真實(shí)吸光度值。
了解UV-Vis光譜實(shí)驗(yàn)中使用的材料和條件非常重要。例如，大多數(shù)塑料比色皿不適用于紫外線吸收研究，因?yàn)樗芰贤ǔ兆贤饩€。玻璃可以充當(dāng)過濾器，通常會吸收大部分UVC(100-280nm)和UVB(280-315nm)但允許一些UVA(315-400nm)通過。因此，紫外檢測需要石英樣品架，因?yàn)槭Υ蟛糠肿贤夤馐峭该鞯摹？諝庖部梢员徽J(rèn)為是一種過濾器，因?yàn)椴ㄩL短于約200nm的光被空氣中的分子氧吸收。波長小于200nm的測量需要特殊且更昂貴的設(shè)置，通常涉及充滿純氬氣的光學(xué)系統(tǒng)。色皿系統(tǒng)也可用于分析非常小的樣品體積，例如在DNA或RNA分析中。
4、檢測
光線穿過樣品后，檢測器用于將光線轉(zhuǎn)換為可讀的電子信號。通常，探測器基于光電涂層或半導(dǎo)體。
光電涂層在暴露于光噴出帶負(fù)電荷的電子。當(dāng)電子被射出時，會產(chǎn)生與光強(qiáng)成正比的電流。光電倍增管(PMT)是紫外-可見光譜中較常用的檢測器之一。參考下圖2，PMT基于光電效應(yīng)，在曝光時首先發(fā)射電子，隨后發(fā)射的電子依次倍增以產(chǎn)生更大的電流。PMT檢測器對于檢測非常低的光強(qiáng)度特別有用。
當(dāng)半導(dǎo)體暴露在光下時，可以通過與光強(qiáng)成正比的電流。更具體地說，光電二和電荷耦合器件(CCD)是兩種常見的基于半導(dǎo)體技術(shù)的檢測器。
使用任何探測器產(chǎn)生電流后，信號就會被識別并輸出到計算機(jī)或屏幕上。如上圖2和下圖3顯示了紫外-可見分光光度計布置的一些簡化示意圖。
圖2：基于比色皿的紫外-可見光譜系統(tǒng)示意圖。
圖3：色皿UV-Vis光譜系統(tǒng)示意圖。
紫外-可見光譜分析、吸收光譜和吸光度單位
UV-Vis光譜信息可以表示為吸光度、光密度或透射率與波長的函數(shù)關(guān)系圖。但是，該信息通常以y軸（縱軸）上的吸光度和x軸（橫軸）上的波長的圖形形式呈現(xiàn)。該圖通常稱為吸收光譜，如下圖4所示。
圖4：從紫外-可見分光光度計獲取的吸收光譜圖。檢查的樣品是溶解在中性pH磷酸鹽緩沖液中的血紅蛋白。
根據(jù)本文前一節(jié)中介紹的紫外-可見分光光度計儀，可以合理地預(yù)期光強(qiáng)度與樣品吸收的光量定量相關(guān)。
吸光度（A）等于涉及的光的強(qiáng)度通過樣品之前的對數(shù)值（Io）通過的光的強(qiáng)度通過樣品（I）。I除以Io的分?jǐn)?shù)也稱為透射率(T)，它表示通過樣品的光量。然而，當(dāng)摩爾吸光率(ε)和路徑長度(L)已知時，比爾-朗伯定律（Beer-Lambert）通常用于在測量吸光度(A)后獲得樣品的濃度(c)。通常，ε以L﹒mol-1cm-1為單位表示，L以cm為單位，c以mol/L為單位表示。因此，A沒有單位。
有時AU用于表示任意單位或吸光度單位，但一般建議不要這樣表示。
如果使用一組測量的包含相同物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液存在線性關(guān)系，Beer-Lambert定律對于獲得物質(zhì)的濃度特別有用。公式1顯示了吸光度、比爾-朗伯定律、儀器中測量的光強(qiáng)度和透射率之間的數(shù)學(xué)關(guān)系。
公式1：此方程顯示了吸光度A、比爾-朗伯定律、儀器中測量的光強(qiáng)度和透射率之間的關(guān)系。
光密度(OD)有時會錯誤地與吸光度互換使用。OD和吸光度都測量光學(xué)組件中光強(qiáng)度損失的量，但OD考慮了光散射的損失，而吸光度則沒有。如果測量中存在非常少的光散射，則可以使用吸光度直接近似估計OD，并且可以使用Beer-Lambert定律。
在測量過程中了解實(shí)驗(yàn)條件很重要。用于1cm路徑長度的比色皿是標(biāo)準(zhǔn)的并且是常見的。有時，可用于檢查的樣本非常少，因此需要小至1毫米的較短路徑長度。如果需要定量，吸光度值應(yīng)保持在1以下，并且保持在儀器的動態(tài)范圍內(nèi)。這是因?yàn)槲舛葹?意味著樣品吸收了90%的入射光，或者等效地表述為10%的入射光透過樣品。由于到達(dá)檢測器的光很少，一些紫外-可見分光光度計不夠靈敏，無法可靠地量化少量光。解決這個問題的兩個簡單可能的解決方案是稀釋樣品或減少路徑長度。
如上所述，使用“空白”參考溶液記錄基線光譜是必不可少的。如果儀器在各方面都好，那么基線對每個檢測波長的吸光度都為零。然而，在實(shí)際情況下，基線光譜通常會有一些非常小的正負(fù)吸光度值。為實(shí)現(xiàn)實(shí)踐，軟件通常會自動從每個光波長的樣品吸光度值中減去這些小的吸光度值，以獲得真實(shí)的吸光度值。
根據(jù)分析的目的，可能需要構(gòu)建校準(zhǔn)曲線。建立校準(zhǔn)曲線需要一些數(shù)據(jù)分析和額外的工作，但根據(jù)吸光度測量值準(zhǔn)確確定樣品中特定物質(zhì)的濃度非常有用。然而，在許多情況下不需要校準(zhǔn)曲線，包括用于細(xì)菌培養(yǎng)的OD測量、在特定波長處獲取吸光度比以評估核酸純度或識別某些藥物。
在紫外可見分光光度計中，選擇對應(yīng)于目標(biāo)物質(zhì)大吸光度的波長進(jìn)行分析。這種選擇確保了大的靈敏度，因?yàn)閷τ谔囟ǖ姆治鑫餄舛瓤梢垣@得大的響應(yīng)。下圖5提供了Food Green 3（一種染料）的UV-Vis吸收光譜示例和使用標(biāo)準(zhǔn)溶液的相應(yīng)校準(zhǔn)曲線。請注意，F(xiàn)ood Green 3染料中存在兩個大吸收峰，一個較小的大吸收峰位于435nm，在619nm處有一個更強(qiáng)烈的大吸收峰。為了在計算未知濃度的Food Green 3時獲得大靈敏度，使用619nm處的大吸光度峰進(jìn)行分析。通過稀釋溶液，進(jìn)行吸光度測量，然后將它們繪制在吸光度與濃度的關(guān)系圖上，以建立濃度和吸光度之間的數(shù)值關(guān)系，從而制備了一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用小二乘線性回歸方程創(chuàng)建校準(zhǔn)曲線。數(shù)據(jù)點(diǎn)越接近直線，擬合越好。直線方程中的y截距設(shè)置為零以表示當(dāng)不存在染料時沒有吸光度。下圖5中所示的方程用于根據(jù)測得的吸光度（變量y）計算未知樣品中Food Green 3（變量x）的濃度。
圖5：左圖顯示了從樣品中的Food Green 3的UV-Vis光譜。右圖顯示的校準(zhǔn)曲線，使用小二乘線性回歸方程從Food Green 3的標(biāo)準(zhǔn)稀釋溶液中得出的。
對于數(shù)據(jù)分析，吸光度與濃度的關(guān)系圖可以表明系統(tǒng)在構(gòu)建校準(zhǔn)曲線時的靈敏度。當(dāng)使用線性小二乘回歸方程時，擬合線的斜率表示靈敏度。如果斜率更陡，則靈敏度更高。靈敏度是區(qū)分樣品濃度微小差異的能力。根據(jù) Beer-Lambert 定律，靈敏度可以部分地由摩爾吸收率ε 表示。事先了解ε值（如果有）有助于確定所需樣品的濃度，尤其是在樣品有限或昂貴的情況下。
為了可靠性和實(shí)踐，應(yīng)重復(fù)紫外-可見光譜實(shí)驗(yàn)和讀數(shù)。在重復(fù)檢查樣品時，通常至少進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)是常見的，但在某些工作領(lǐng)域需要進(jìn)行更多次重復(fù)試驗(yàn)。計算出的數(shù)量，例如未知樣品的濃度，通常報告還應(yīng)該帶有標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值?？芍噩F(xiàn)的結(jié)果對于確保準(zhǔn)確、高質(zhì)量的測量至關(guān)重要。標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差或變異系數(shù)有助于確定系統(tǒng)和測量的準(zhǔn)確度，較低的偏差或變化表明較高的精度和可靠性水平。
紫外可見分光光度計的優(yōu)勢和局限性
沒有一種技術(shù)是好的，紫外-可見光譜也不例外。但是，該技術(shù)確實(shí)具有以下的一些主要優(yōu)勢，使其應(yīng)用廣泛。
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該技術(shù)是非破壞性的，允許重復(fù)使用樣品或進(jìn)行進(jìn)一步處理或分析；
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可以快速進(jìn)行測量，從而可以輕松集成到實(shí)驗(yàn)方案中；
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儀器易于使用，使用前幾乎不需要培訓(xùn)；
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數(shù)據(jù)分析通常需要少許的處理，這同樣意味著需要很少的用戶培訓(xùn)；
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該儀器的購置和操作成本通常較低，因此可供許多實(shí)驗(yàn)室使用。
雖然這種技術(shù)的優(yōu)勢看起來非常明顯，但也存在一定的弱點(diǎn)：
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雜散光
在實(shí)際儀器中，波長選擇器并不好，來自寬波長范圍的少量光仍可能從光源傳輸，這可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的測量錯誤。雜散光也可能來自環(huán)境或儀器中安裝松散的隔間。
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光散射
光散射通常是由液體樣品中的懸浮固體引起的，這可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的測量誤差。比色皿或樣品中存在的氣泡會散射光，導(dǎo)致無法重現(xiàn)的結(jié)果。
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來自多個吸收物種的干擾
例如，樣品可以具有多種類型的綠色葉綠素。在同一樣品中一起檢查時，不同的葉綠素將具有重疊的光譜。為了進(jìn)行適當(dāng)?shù)亩糠治觯瑧?yīng)將每種化學(xué)物質(zhì)從樣品中分離出來并單獨(dú)檢查。
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組件的偏差
任何儀器組件未對準(zhǔn)定位，尤其是固定樣品的比色皿，都可能產(chǎn)生不可重復(fù)和不準(zhǔn)確的結(jié)果。因此，重要的是儀器中的每個組件都以相同的方向?qū)R，并在每次測量時放置在相同的位置。因此，一般建議進(jìn)行一些基本的操作培訓(xùn)，以避免誤差。
紫外可見分光光度計的應(yīng)用
UV-Vis已發(fā)現(xiàn)其適用于許多用途和情況，包括但不限于：
1、DNA和RNA分析
快速驗(yàn)證RNA和DNA的純度和濃度是一種特別廣泛的應(yīng)用。下表1中給出了分析中使用的波長及其指示的摘要。在制備DNA或RNA樣品時，例如用于測序等下游應(yīng)用時，通常重要的是要驗(yàn)證其中一個樣品沒有被其他，或從分離過程中攜帶的蛋白質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)。
260nm/280nm吸光度(260/280)比值可用于揭示核酸樣品中可能存在的污染，如下表2所示。純DNA的260/280比值通常為1.8，而純RNA的比值通常為2.0 .純DNA的260/280比值低于RNA，因?yàn)樵赗NA中被尿嘧啶取代的胸腺嘧啶的260/280比值低于尿嘧啶。由于280nm處的吸光度較高，被蛋白質(zhì)污染的樣品會降低260/280比值。
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用于吸光度分析的波長（nm） |
這個波長的紫外吸光度表明存在什么物質(zhì)？ |
是什么導(dǎo)致此波長的紫外線吸收？ |
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230 |
蛋白質(zhì) |
蛋白質(zhì)形狀 |
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260 |
DNA和RNA |
腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶 |
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280 |
蛋白質(zhì) |
主要是色氨酸和酪氨酸 |
表1：確定260/280和260/230吸光度比值時有用的UV吸光度匯總。
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吸光度比 |
典型值 |
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260/280 |
純DNA的典型吸光度比為1.8 純RNA典型的吸光度比為2.0 |
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260/230 |
吸光度比不同；2.15至2.50典型值用于RNA和DNA |
表2：DNA和RNA分析的預(yù)期紫外線吸光度比值總結(jié)。
260nm/230nm吸光度(260/230)比率也可用于檢查DNA和RNA樣品的純度，并可揭示蛋白質(zhì)或化學(xué)污染。蛋白質(zhì)可以吸收230nm的光，從而降低260/230比率并指示DNA和RNA樣品中的蛋白質(zhì)污染。硫氰酸胍和異硫氰酸胍是純化核酸中常用的兩種化合物，在230nm處有強(qiáng)烈吸收，這也會降低260/230的吸光度比值。
2、藥物分析
UV-Vis光譜常見的用途之一是在制藥行業(yè)。使用數(shù)學(xué)導(dǎo)數(shù)處理UV-Vis光譜允許解析原始光譜中的重疊吸收峰以識別單個藥物化合物。例如，苯佐卡因（一種局部麻醉劑）和金霉素（一種抗生）可以通過將一個數(shù)學(xué)導(dǎo)數(shù)應(yīng)用于吸光度光譜，同時在商業(yè)獸用粉末制劑中進(jìn)行鑒定。通過為每種化合物構(gòu)建校準(zhǔn)函數(shù)，可以在微克/毫升的濃度范圍內(nèi)同時定量這兩種物質(zhì)。
3、細(xì)菌培養(yǎng)
紫外可見分光光度計常用于細(xì)菌培養(yǎng)。OD測量通常使用600nm的波長快速進(jìn)行，以估計細(xì)胞濃度并跟蹤生長。600nm是常用和優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈冊谄渲猩L的細(xì)菌培養(yǎng)基的光學(xué)特性以及避免在需要繼續(xù)實(shí)驗(yàn)的情況下?lián)p壞細(xì)胞。
4、飲料分析
識別飲料中的特定化合物是紫外可見光譜的另一個常見應(yīng)用。含量須在一定的法律限制內(nèi)，紫外線可以促進(jìn)量化。某些類別的有色物質(zhì)，例如在藍(lán)莓、覆盆子、黑莓和櫻桃中發(fā)現(xiàn)的花青素，可以通過匹配它們在葡萄酒中的已知峰值吸收波長來輕松識別，以便使用紫外可見吸收進(jìn)行質(zhì)量控制。
5、其他應(yīng)用
這種技術(shù)也可用于許多其他行業(yè)。例如，測量顏色指數(shù)可用于監(jiān)控變壓器油，作為確保電力輸送的預(yù)防措施。測量血紅蛋白的吸光度以確定血紅蛋白濃度可用于癌癥研究。在廢水處理中，UV-Vis光譜可用于動力學(xué)和監(jiān)測研究，通過比較一段時間內(nèi)的光譜，確保某些染料或染料副產(chǎn)品已被正確去除。
UV-Vis光譜在一些更專業(yè)的研究中也非常有用。在對應(yīng)于吸收峰的波長的跟蹤變化是在檢查特定結(jié)構(gòu)蛋白改變有用和在確定電池組合物。峰值吸收波長的偏移也可用于更現(xiàn)代的應(yīng)用，例如非常小的納米粒子的表征。這種技術(shù)的應(yīng)用多種多樣，而且似乎無窮無盡。